Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Главное отличие ПЦР от других методов диагностики – тест-система определяет ДНК вируса. Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. Исследования, проводимые одним из широко применяемых методов – методом, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР), являются наиболее точными и достоверными.
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
Затем в лабораторных условиях образец размножается и анализируется. ПЦР - более чувствительный тест, чем исследование на антиген, поскольку он может обнаружить одну молекулу РНК в микролитрах раствора. В настоящее время это золотой стандарт диагностики коронавируса. Прежде всего, это высокая чувствительность, т. Во-вторых, тест также высокоспецифичный точный , то есть сводит к минимуму риск ложноположительных результатов правильно определяет здоровых людей. Еще одно преимущество метода - скорость и повторяемость.
ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г.
Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды.
В связи с широкой распространенностью данной диагностической методики, у пациентов часто возникает вопрос: ПЦР анализ — что это такое? Цена анализа относительно не высокая, несмотря на то, что процедура позволяет получить достоверный результат. Анализ крови ПЦР — что это такое? Полимеразная цепная реакция представляет собой исследование, суть которого заключается в проведении амплификации множественное копирование генетического материала инфекционного агента.
Оно необходимо для последующей идентификации генома и видовой принадлежности микроорганизмов.
Анализ соскоба из уретры или влагалища в гинекологии позволяет определить: - количество лейкоцитов их повышение говорит об инфекции, но у здоровых женщин небольшое число лейкоцитов присутствует во флоре ; - количество эритроцитов основной показатель воспалительного процесса при повышенном количестве ; -состав флоры у женщин он зависит от менструального цикла, но активность клеток говорит о нарушении микрофлоры ; - наличие трихомонады, гонококков, грибка — основная цель для выявления возбудителя инфекций; - наличие лактобацилл их отсутствие говорит о нарушенной микрофлоре. Также мазок определяет степень чистоты влагалища женщины: 1 и 2 степень — характерна для здоровой флоры, а 3 и 4 — выявляет кольпит, воспаление. Преимущества данного метода состоят в простоте, доступности и быстроте получения результатов 30 - 60 мин и менее. Однако чувствительность данного метода ограничена около 105 бактерий в 1 мл. Практически не определяются в урогенитальном мазке вирусы, хламидии, микоплазмы и уреаплазмы, и одних только результатов мазка часто бывает недостаточно для постановки диагноза. Результаты мазка обычно можно использовать как ориентировочные. Перед сдачей мазка лучше воздержаться от мочеиспускания. Бактериологический метод бакпосев Бакпосев — метод диагностики ЗППП путем выращивания микробов в благоприятной для этого среде.
Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. Флуоресцентные методы детектирования продуктов ПЦР расширяют возможности применения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК. Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР.
Принципы ПЦР-диагностики
Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа. Метод обладает высочайшей чувствительностью — мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя. Несомненное преимущество метода — оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день. При помощи ПЦР определяют возбудителя , а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с так называемым «человеческим фактором».
ПЦР — очень высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание». Оценивать результаты реакции должен практический врач, который лечит конкретного больного. Дело в том, что далеко не всегда положительный ответ теста означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР — результат окажется положительным. Другой вариант — это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой.
Это позволяет избежать контаминации загрязнения материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР. Словарь ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. Процесс этот называется транскрипцией. Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу.
Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый A , содержащий аденин, гуаниновый G - гуанин, цитозиновый C - цитозин, тиминовый Т - тимин, урациловый U - урацил. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания. Праймер — котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. Литература Глик Б. Молекулярная биотехнология.
В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их "видеть". Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК. Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание". Применение ПЦР ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими. Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его.
Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека. Принцип ПЦР- исследования У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» - ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота , которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль считается, что для компактности. Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин А , гуанин Г , тимидин Т и цитозин ц. Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте — РНК. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний бактерии, грибки и вирусы были созданы свои специфические генетические детекторы праймеры - уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации — создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, то есть «обнаружено» или «не обнаружено». Кому мы обязаны появлением метода ПЦР? Со слов американского биохимика Керри Мюллиса Kary Mullis , идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода ДНК пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга Arthur Kornberg , которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества. Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
Чем отличается диагностика ПЦР от ИФА
| ПЦР-тест: что это, расшифровка анализа, как его делают | Согласно внесенным изменениям в санитарные правила, при контакте с зараженным коронавирусной инфекцией тест на COVID-19 методом ПЦР следует делать только при появлении симптомов. |
| Диагностика COVID-19: обзор основных методов | При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. |
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности | По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. |
| ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции | Нельзя ПЦР или ИФА-диагностикой заменить все существующие методы исследования. |
Принципы ПЦР-диагностики
В России начали внедрять в клиническую практику ПЦР-анализы на коронавирусную инфекцию по любым доступным пробам биологических жидкостей. Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis. С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала.
Достоверность метода ПЦР
Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Групп-специфическая ПЦР англ. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Какие биологические материалы исследуются? Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб. Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный одноразовый флакон. Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек.
Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем ЗППП , таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.
Если кровь, то особо готовиться не надо. Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории если обследование положено по ОМС , или в частной, где окажутся подходящие цены. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Если указания на метод нет — выбирайте ту лабораторию, цены в которой вас устраивают.
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.
Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.
Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты.
Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 30 лет и позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Этот метод нашел применение в: диагностике инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию: в клинической диагностике вирусных и бактериальных инфекций; диагностике наследственных муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия , онкологических и др. Кроме того, молекулярные методы используются в таких областях, как эпидемиология, фармакология, экология, сельское хозяйство, пищевая промышленность, биотехнология. Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. История открытия и разработка метода пцр Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК.
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
Затем в лабораторных условиях образец размножается и анализируется. ПЦР - более чувствительный тест, чем исследование на антиген, поскольку он может обнаружить одну молекулу РНК в микролитрах раствора. В настоящее время это золотой стандарт диагностики коронавируса. Прежде всего, это высокая чувствительность, т. Во-вторых, тест также высокоспецифичный точный , то есть сводит к минимуму риск ложноположительных результатов правильно определяет здоровых людей. Еще одно преимущество метода - скорость и повторяемость.
Хорошие результаты показывает проведение анализа, когда материал для исследования взят из цервикального канала или уретры. В этом случае лучше всего провести ПЦР-диагностику не позже, чем через сутки после полового акта.
Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Асимметричная ПЦР англ. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Групп-специфическая ПЦР англ. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Какие биологические материалы исследуются?
Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб. Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный одноразовый флакон.
Хранение и транспортировка биоматериалов Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре. После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено. В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит.
Как подготовиться к ПЦР-диагностике? Правила довольно просты: Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища спринцевания, свечи. Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию если таковая проводилась не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа; Кровь сдается из вены утром натощак; Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов — максимум 2 часа; Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой. Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз.
Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки. Результаты ПЦР-анализа Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный. И если условия подготовки, сбора биоматериала, проведения анализа и оценки итогов не были нарушены, то нет и причин сомневаться в достоверности полученных данных. По-другому дело обстоит в случае с ПЦР количественной. Её результатом является число, демонстрирующее вирусную нагрузку. Чтобы понять, о какой цифре идёт речь, достаточно произвести умножение.
Сколько стоит сдать ПЦР? Цены сильно разнятся в зависимости от региона и типа клиники.
Он позволит быстро отличить «Омикрон» от «Дельты» и предпринять необходимые меры, чтобы не допустить распространения опасного штамма. Причем использовать метод можно в тех лабораториях, где нет специального оборудования для секвенирование.
Ученые подчеркивают, что на данном этапе разработка будет Об эффективности российской вакцины Владимир Путин рассказал на неформальном саммите СНГ использоваться только как лабораторная методика и не будет регистрироваться как коммерческое медицинское изделие. Хотя тесты ПЦР сильно уступают в точности выявления конкретных штаммов, метод может найти применение в части научных исследований, рассказали «Известиям» опрошенные эксперты. Генотипирование методом ПЦР может использоваться только для ориентировочного определения какого-либо из штаммов, — считает руководитель медицинской онлайн-лаборатории Lab4U Валерий Саванович. Исходя из описания, представляется, что данная разработка может быть полезна в период высокой распространенности штамма «Омикрон» в стационарах и поликлиниках, считает директор департамента медицинского маркетинга группы компаний «Инвитро» Татьяна Понкратова.
При этом Понкратова подчеркнула, что информация о штамме имеет весьма скромную пользу для самого пациента в отрыве от рекомендаций лечащего врача. Директор по лабораторным технологиям лаборатории «Гемотест» Тамара Силкина отметила, что ЦНИИЭ Роспотребнадзора — организация, которая обязана контролировать эпидемиологическую ситуацию в стране. Для этого и нужно разрабатывать методики быстрого определения опасных штаммов.
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
| Все под контролем! Правильный способ использования внутреннего контрольного образца (ВКО) | Узнайте, что такое ПЦР-анализ, виды тестов и показания к проведению диагностики, преимущества и недостатки метода. |
| Микробиологические исследования | Что такое ПЦР, как работает метод ПЦР в диагностике, преимущества методики, показания, подготовка к проведению ПЦР-анализа, как проводится ПЦР-анализ, что показывают результата теста. |
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей. ПЦР называют прямым методом, поскольку он выявляет возбудителя, а не иммунную реакцию организма, и является подтверждающим методом в диагностике инфекционных заболеваний. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis. В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов. Согласно внесенным изменениям в санитарные правила, при контакте с зараженным коронавирусной инфекцией тест на COVID-19 методом ПЦР следует делать только при появлении симптомов.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
| Мутации врозь: ПЦР-тесты научились отличать «Омикрон» от «Дельты» | Статьи | Известия | читайте в медицинском журнале клиники Адмиралтейские Верфи. |
| ПЦР-анализ: метод диагностики, выявляемые инфекции | Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. |
| Что такое анализ ПЦР и как его проводят | Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. |
| Методы диагностики ЗППП | Молекулярно-биологические исследования с применением метода полимеразной цепной реакций (ПЦР). |
| Микробиологические исследования | Метод ПЦР позволяет выявить наличие определенной ДНК последовательности с мутацией и подтвердить диагноз. |
Какой лучше: достоинства и недостатки разных методов молекулярной диагностики
- ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
- Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
- Принципы ПЦР-диагностики
- ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
- Разновидности ПЦР
- Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Особенность этого фермента - он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а "любимый" его температурный режим во время работы - 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре. С момента появления метода, ПЦР-исследования завоевывают все большую и большую популярность. Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет избежать ошибок и ложноположительных результатов, связанных с контаминацией и значительно ускорить получение результата. ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к. Гордиев М. Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога. Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера - низкая чувствительность. Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов как следствие - пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным. Учитывая развитие и доступность в России в том числе по ОМС в МИБС более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии. При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика? Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки секвенирования ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций. В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома. Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли.
Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание». Оценивать результаты реакции должен практический врач, который лечит конкретного больного. Дело в том, что далеко не всегда положительный ответ теста означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР — результат окажется положительным. Другой вариант — это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин — материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория. Когда следует бежать в лабораторию, чтобы проанализировать итоги вашего летнего отпуска? Специалисты советуют делать это в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов, дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений цвет, количество, консистенция , случайный половой контакт без применения презерватива. Чаще всего его используют для диагностики именно заболеваний, передающихся половым путем. В этих случая обычно материалом для исследования является мазок. Например, мазок на хламидии у женщин берут из влагалища, у мужчин — из уретры. Для анализа биоматериалом могут быть и слюна, и кровь, и моча, и выделения половых органов. В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом. Лучше всего комбинировать различные методы исследования — помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА.
В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды" со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически. Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Кинетическая кривая в координатах "Уровень репортерной флуоресценции - цикл амплификации" имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии: 1. Стадию инициации когда ПЦР-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой. Экспоненциальную стадию в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР. Плато стадию насыщения. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляется концентрация исходной матрицы ДНК. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4. В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед культуральным методом обнаружения микроорганизмов состоит в следующем:. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма. Время, необходимое для обнаружения возбудителя культуральным методом, составляет около 4 суток, тогда как использование ПЦР позволяет обнаружить микроб через 4-5 часов. Использование технологии ПЦР позволяет проводить определение возбудителей, например хламидий, в образцах, взятых неинвазивным путем, например в порциях мочи. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Данный метод сравним по трудоемкости с классическими методами иммуноферментным, иммунофлуоресцентным и т. Поэтому метод ПЦР, наравне с культуральным методом, признается «золотым стандартом» для диагностики инфекционных заболеваний. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4-8 недель. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа. Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР-диагностикумов. В настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя , которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок. Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны за исключением случая однояйцевых близнецов , родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции. Особую диагностическую ценность ПЦР для обнаружения этого вируса представляет по следующим причинам: отсутствие способа культивирования ВГС; 2 наборы для антигенной диагностики не существуют; 3 реакция образования антител к ВГС настолько замедлена, что диагноз во время острой фазы инфекции, как правило, поставить невозможно. Поэтому в настоящее время становится общепризнанным использование технологии ПЦР для диагностики, контроля качества лечения и эпидемиологического анализа заболеваемости, обусловленной ВГС. При этом только технология ПЦР позволяет решать следующие задачи: 1 проводить диагностику острой инфекции при позднем выявлении антител к ВГС; 2 осуществлять этиологическую диагностику хронического гепатита С у иммуносупрессированных пациентов; 3 оценивать эффективность противовирусной терапии; 4 выявлять виремию у доноров крови с нормальным уровнем аминотрансфераз; 5 определять возможную контаминацию препаратов крови; 6 оценивать широту распространения ВГС. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя С. Использование метода ПЦР позволяет значительно улучшить раннюю диагностику туберкулеза.