читайте в нашей статье. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Главное отличие ПЦР от других методов диагностики – тест-система определяет ДНК вируса.
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом. полимеразная цепная реакция. Основу процесса исследования составляет метод ПЦР в реальном времени, который зарекомендовал себя как очень быстрый и чувствительный способ, подчеркивают в Роспотребнадзоре. • При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром.
Принципы ПЦР-диагностики
Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний наследственных, инфекционных. Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях in vitro. Метод ПЦР имеет очень высокую информативность и позволяет легко и эффективно определять наличие микобактерии в организме, но, только если проводить анализ мокроты если это туберкулез органов дыхания или мочи при туберкулезе орагнов мочевыделительной системы , а не крови. ПЦР анализ крови на туберкулез нельзя считать информативным, так как ДНК микобактерии туберкулеза в крови бывает только у больных туберкулезным сепсисом, что на практике встречается весьма редко.
Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов. Сначала, с помощью того же фермента обратной транскриптазы, которую используют для изготовления библиотек клонов кДНК, на основе интересующей мРНК синтезируется однонитевая кДНК. Один из олигонуклеотидов запускает синтез второй нити кДНК, полученная двойная спираль затем служит в качестве объекта ПЦР. ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика.
Она позволяет обнаружить, проанализировать и измерить специфические последовательности гена в образце ДНК пациента, не клонируя его и не прибегая к блоттингу. Анализ можно выполнять даже из нескольких клеток буккального эпителия после полоскания рта, из единственной клетки, взятой у 3-дневного эмбриона, содержащего четыре или восемь клеток, из спермы во влагалищном тампоне, полученном от жертвы изнасилования, или из капли сухой крови на месте преступления.
Однако в условиях быстрого распространения нового штамма необходимы и более простые методы его обнаружения. Их удалось разделить на варианты «Дельта» и «Омикрон» с высокой точностью. Увидел — победил Новый метод — простой, быстрый и недорогой, подчеркивают в Роспотребнадзоре. Он позволит быстро отличить «Омикрон» от «Дельты» и предпринять необходимые меры, чтобы не допустить распространения опасного штамма. Причем использовать метод можно в тех лабораториях, где нет специального оборудования для секвенирование. Ученые подчеркивают, что на данном этапе разработка будет Об эффективности российской вакцины Владимир Путин рассказал на неформальном саммите СНГ использоваться только как лабораторная методика и не будет регистрироваться как коммерческое медицинское изделие. Хотя тесты ПЦР сильно уступают в точности выявления конкретных штаммов, метод может найти применение в части научных исследований, рассказали «Известиям» опрошенные эксперты. Генотипирование методом ПЦР может использоваться только для ориентировочного определения какого-либо из штаммов, — считает руководитель медицинской онлайн-лаборатории Lab4U Валерий Саванович.
Исходя из описания, представляется, что данная разработка может быть полезна в период высокой распространенности штамма «Омикрон» в стационарах и поликлиниках, считает директор департамента медицинского маркетинга группы компаний «Инвитро» Татьяна Понкратова.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды вода, почва и т. В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза , гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв.
Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями.
Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации.
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает высокой специфичностью при выявлении РНК SARS-CoV-2. это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Главное отличие ПЦР от других методов диагностики – тест-система определяет ДНК вируса. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале.
Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое.
Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.
Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
Расшифровка анализа ПРЦ Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой. Результаты пцр анализа можно получить через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день, и вот что они могут означать: Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель. В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве. Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита. Насколько точна ПЦР диагностика инфекций? Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен: точно определить наличие или отсутствие инфекции; точно указать, что именно это за инфекция специфичность ; обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале, который был подвергнут исследованию чувствительность.
ПЦР анализ: цена и сроки Цена конкретного анализа будет зависеть от того, на какую инфекцию вы будете проверяться. Примерные цены и сроки: ИППП: 300-500 руб, сроки — 1 день; Вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы человека, герпеса, цитомегаловирус: 300-500 руб, сроки — 1 день; Гепатит A, B, C, D, G: качественный анализ 650 руб, количественный анализ 2000 руб.
Какие биологические материалы исследуются? Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб.
Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный одноразовый флакон. Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем ЗППП , таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции. Кровь, плазма, сыворотка.
Как подготовиться к сдаче анализа? Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование.
За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом , метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце. Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры из предыдущего пункта и специальные приборы ДНК-амплификаторы.
Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце. Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени — единственный доступный метод количественной оценки. Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат. Преимущества методики ПЦР Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность для положительного результата достаточно 40! Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов буфера, праймеров, раствора для отмывки и т. Области применения в медицине В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др. А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию. Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ.
Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа. В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит — назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения. Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза болезни Лайма , клещевых энцефалитов.
Что такое ПЦР анализ
Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности.