Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является мощнейшим инстументом современной молекулярной биологии. Что представляет собой анализ методом ПЦР? ПЦР — это полимеразная цепная реакция. Виды теста методом полимеразной цепной реакции: качественная, количественная и генотипирование. Как правильно сдавать анализ и расшифровка отрицательного результата ПЦР при положительных показателях ИФА. Тесты на ВПЧ могут быть качественными (простой ПЦР) и количественными (Digene test, ПЦР), они предназначены для выявления некоторых типов папилломавирусов.
Почему "ошибаются" ПЦР-тесты - эксперт
Тест на коронавирус, проводимый через полимеразную цепную реакцию, позволяет определить, болеет обследуемый или нет. Точное расшифровка названия ПЦР — это полимеразная цепная реакция, которая способна выявлять даже единичные бактерии и вирусы, то есть в очень малых концентрациях. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный).
Расшифровать анализ ПЦР онлайн
Чаще всего ПЦР-тест показывает ложноположительный результат из-за наличия в носу или ротоглотке фрагментов уже погибшего вируса, рассказал в интервью Лайфу доктор медицинских наук, практикующий врач, профессор Антон Ершов. Чаще всего ПЦР-тест показывает ложноположительный результат из-за наличия в носу или ротоглотке фрагментов уже погибшего вируса, рассказал в интервью Лайфу доктор медицинских наук, практикующий врач, профессор Антон Ершов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это лабораторно–диагностическое исследование, позволяющее определить возбудителя той или иной инфекции. Тест на антиген коронавируса проводится по методике ПЦР, когда у пациента при помощи ватной палочки берется из глотки проба слюны.
Чувствительность определения 60 МЕ/мл — что это значит?
Хронические заболевания и беременность также влияют на показатель. Специфическая Среди таких методов диагностики чаще всего используются два вида. Экспресс-тесты Дают возможность узнать, выработался ли у человека иммунитет к вирусу. Для этого проводятся исследования на наличие двух антител: G и M.
Если результат такого иммунохроматографического ИХГ теста положительный, это свидетельствует о том, что заболевание в организме протекает уже больше недели. ИХГ анализ помогает быстро выявить даже бессимптомный коронавирус. Кроме того, можно оценить уровень иммунной защиты организма.
Отличие экспресс-тестов от обыкновенных не только в быстром результате, но и в месте проведения. Делаются такие не в специальной лаборатории, а локально. Берется кровь из пальца либо из вены.
Это очень удобно, если необходимо протестировать много людей вне медицинского учреждения. Например, летом 2020 года власти Германии решили бесплатно тестировать таким методом иностранных туристов, которые прибывали в аэропорт. Особенно важно провериться на наличие антител IgG и IgM тем категориям населения, которые контактируют со множеством людей и находятся в группе риска.
ПЦР-диагностика рекомендована таким категориям населения: людям, имеющим симптомы COVID-19, длительное время повышенную температуру, сухой кашель и пр. Тест на антитела к COVID-19 При вторжении в организм патогенного агента иммунная система начинает вырабатывать специфические белки-иммуноглобулины Ig , способные запомнить и нейтрализовать этот микроорганизм. Таким образом, повторная встреча с данным возбудителем будет неопасна. Организм быстро его инактивирует. IgM обнаруживаются в анализе на 7-10 день после инфицирования с 5-го дня появления клинических признаков заболевания и остаются в организме до двух месяцев. Поскольку иммуноглобулины начинают вырабатываться не с первого дня инфицирования, то и тест на антитела сначала может быть отрицательным, ведь исследование может проводиться в период, когда организм еще не успел сформировать иммунный ответ. Логично обнаружить IgM в разгар заболевания и сразу после регресса симптоматики. IgG вырабатываются позже, примерно с 21-28 дня от момента заражения, и сохраняются в организме более продолжительное время, в течение нескольких месяцев или лет. Следовательно, обнаружить их удастся только на стадии выздоровления или в более поздние сроки.
Подготовка к обследованию Для проведения анализа методом полимеразной реакции необходима венозная кровь. Это необходимо сделать утром на голодный желудок. Пациенту следует правильно подготовиться к исследованию: За 10 часов отказаться от пищи, можно пить только чистую воду. Накануне прекратить прием алкоголя, за 4 часа не курить. Перед обследованием стоит избегать физических и эмоциональных стрессов. За 2 суток перестать употреблять лекарства, если это невозможно, то необходимо предупредить лаборанта. Некоторые препараты оказывают влияние на конечный результат. Интерпретация данных При количественной реакции оценивают полученные показатели в зависимости от числа копий ДНК Интерпретировать данные качественного измерения несложно. Он дает либо положительный, либо отрицательный ответ. При количественной реакции оценить полученные показатели можно в зависимости от числа копий ДНК. У пациента развился поствакцинальный иммунитет, либо он излечился от болезни. При числе копий 2х100 говорят о носительстве вируса. Количество 2х106 свидетельствует о хронической стадии болезни. При ДНК более 2х109 пациент болен острой стадией гепатита. Ошибочные результаты Преимущества метода диагностики с помощью полимеразных реакцийи заключаются в следующем: Прямое обнаружение возбудителей. В отличие от него, метод ИФА дает информацию о присутствии антител к вирусу. То есть копируется именно участок ДНК, который имеется в образце биоматериала. Повышенная чувствительность. Метод может обнаружить даже единичные фрагменты клеток. Диагностика болезней в острой и в скрытой стадии.
Затем идет анализ и сравнение результата с имеющейся базой данных о строении различных возбудителей. Посредством ПЦР можно не только выявить тип возбудителя, но и выдать количественный результат анализа, то есть как много возбудителей в организме человека. Метод ПЦР в настоящее время расширяет круг возможностей проводимых исследований: введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК, и получил широкое распространение в медицине, к примеру, для установления отцовства, появление новых генов и прочее. Материал для исследования и правила его забора Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость. При обследовании на инфекции, передающиеся половым путем ИППП , у мужчин и женщин забираются выделения из половых органов, мазок или соскоб из шейки матки, мазок или соскоб из уретры мочеиспускательного канала , моча. Нередко для обследования на поражение нервной системы при ряде исследований забирается спинномозговая жидкость. В пульмонологии материалом служит мокрота, плевральная жидкость. При обследовании на внутриутробные инфекции — околоплодные воды, ткани плаценты. Подготовка к сдаче материала и проведению ПЦР-диагностики Практически все пациенты, которым проводится ПЦР-диагностика, вправе рассчитывать на достоверный, точный и быстрый результат, зависящий в большой степени от возможности лаборатории, профессионализма врача-лаборанта. Вместе с тем, многие не задумываются, что эта самая достоверность во многом зависит и от нас самих, а именно от рекомендаций лечащего доктора, образа жизни и правильности забора материала. При заборе материала требуются условия, исключающие контаминацию загрязнение материала и, соответственно, ставящие под сомнение объективность анализа. Правильная подготовка к сдаче материала не представляет особых сложностей. Существуют следующие рекомендации врачей для пациентов: 1 не жить половой жизнью за сутки до сдачи материала; 2 кровь для исследования сдается утром натощак не есть, не пить ; 3 при сдаче мочи собирается первая утренняя порция в чистый стерильный контейнер.
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
То есть копируется именно участок ДНК, который имеется в образце биоматериала. Повышенная чувствительность. Метод может обнаружить даже единичные фрагменты клеток. Диагностика болезней в острой и в скрытой стадии. То есть, можно диагностировать болезнь на этапе доклинических проявлений. У метода есть недостатки, которые приводят к ложным результатам. Самый существенный недостаток — вероятность загрязнения материала.
Основным источником загрязнения являются плохо обработанные пробирки, руки лаборанта, реактивы. В кровь может попасть часть ДНК от предыдущей реакции. Поэтому к лабораториям предъявляются повышенные санитарные требования: раздельные помещения, пластиковые пробирки, обработка лабораторий ультрафиолетом и т. Ложноотрицательные результаты могут быть следствием сниженной чувствительности реакции. Это происходит в следующих ситуациях: пациент принимает лекарственные препараты, например, антикоагулянты; человек перед анализом перенес физическое напряжение занятия спортом, тяжелая работа ; заражение произошло недавно. Если у пациента есть высокая вероятность инфицирования, а результат исследования отрицательный, ему необходимо повторное обследование.
Заключение Метод полимеразной цепной реакции является основным и самым информативным для диагностики ВГВ. Он позволяет не просто установить носительство инфекции, но и уточнить этап заболевания, оценить результаты лечения. Для более точного диагноза применяют качественное и количественное измерение. К недостаткам способа можно отнести вероятность загрязнения, снижение чувствительности и довольно высокую цену. Для того, чтобы результаты были наиболее достоверными, следует правильно подготовиться к исследованию и проводить его в клинике с соответствующей лицензией и хорошей репутацией. Благодаря ее знаниями в диетологии, на основании диагностики проводит полный комплекс терапии внутрибрюшных органов.
Другие авторы.
Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК. РНК-праймер изображен белым прямоугольником в начале каждой из двух цепей Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают.
На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется см.
Общая схема полимераной цепной реакции. Цифрами обозначены ее этапы. В случае с вирусами, содержащими не «двойную» ДНК молекулу, а «одинарную» РНК а это коронавирусы, или, например, ВИЧ , ученым приходится сначала провести обратную транскрипцию РНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а уже потом производить амплификацию по той схеме, что была указана выше.
Именно так, собственно, поступает и сам вирус, попадая в клетку, перед тем как встроить свою ДНК в человеческую и приступить к синтезу собственных белков, из которых состоит его «тело» то есть не генетического материала, а самих вирусных частиц, при ПЦР же, наоборот, копируется генетический материал, а не новые частицы вируса. Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.
Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах Thermal cycler. Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео. У теста на антитела свои преимущества.
Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом.
При контакте биоматериала с реагентом происходит реакция с окрашиванием как с тестом на беременность. Такое исследование на коронавирус достаточно быстрое до 20 минут , однако не слишком точно. Тест на антитела Антитела к коронавирусу, выявленные в организме, показывают его реакцию на возбудитель. Если он вырабатывает специфические иммуноглобулины, это может означать, что: человек переболел COVID-19 в том числе бессимптомно ; антитела способны бороться с вирусом в случае его повторного проникновения в кровь; человек может быть донором и спасать других зараженных, кто переносит заболевание тяжелее. Если тестирование показало, что антитела к коронавирусу присутствуют, это еще не значит, что их носитель больше никогда не заболеет. Хотя статистика имеется небольшая, вирусологи пришли к выводу, что положительный тест на антитела может ненадолго приравниваться к вакцинации. Однако это справедливо в течение полугода после выявления инфекции.
По истечении этого срока вновь появляются риски, и пациенту рекомендована прививка. Как расшифровать анализ на антитела? Обследуемый на антитела может иметь в организме несколько видов белков, вырабатываемых иммунной системой: IgM — реакция на любую острую инфекцию. Обычно присутствуют в организме в течение месяца после заражения, однако при COVID-19 этот срок увеличивается до 3 месяцев. Могут сохраняться даже в отсутствие вируса. Их количество должно снижаться по мере выздоровления. IgG — запоминающая реакция организма на перенесенную инфекцию.
Синтезируются через 6 недель после заражения и формируют иммунитет. Если в анализе на антитела есть IgA, значит, человек столкнулся с коронавирусом. Если их сопровождают IgG, то больной выздоравливает, если нет — инфекционное заболевание протекает в данный момент. Об устойчивости иммунной системы к вирусу говорит показатель IgG более 1,1. Возможен ли экспресс-анализ? Пройти диагностику на антитела можно и в домашних условиях. Брать ее можно как из пальца, так и из вены, хотя второй способ без медсестры реализовать сложно.
Проходить экспресс-диагностику на антитела лучше натощак. В набор входит одноразовый ланцет для прокола кожи. Кровь помещается в лунку тестового устройства, где смешивается с буферной жидкостью.
Несмотря на понятность анализа, нельзя самостоятельно ставить себе диагноз и заниматься самолечением, результаты анализа нужно показать лечащему врачу. Как подготовиться к сдаче анализа Для того чтобы получить достоверный результат, важно соблюсти ряд правил: Сдавать анализы стоит утром натощак постараться поесть в последний раз минимум за 8 часов до процедуры. Нельзя перед сдачей крови пить что-то, кроме воды.
За два дня нужно исключить жирные и жареные продукты, а также алкоголь. Минимум за час лучше отказаться от сигарет. Не рекомендуется сдавать анализы после массажа, УЗИ или рентгена. За день до обследования пациент должен отказаться от медицинских препаратов, физической активности и эмоциональных нагрузок. Полчаса перед обследованием стоит провести спокойно и расслаблено. На скорость проведения обследования ПЦР влияет то, каким из типов вируса страдает пациент, каким методом проводится анализ крови.
В зависимости от сложности результаты анализов больной может получить через несколько часов или несколько дней. Но обычно это не занимает больше 7 суток. На стоимость ПЦР-исследования влияет статус клиники, куда пациент обратится, и от того, насколько сложным будет проведение анализа. Цена варьируется от 400 рублей до 11 тысяч. Пациенту важно знать, что есть такое понятие, как отрицательно ложные анализы. Это может произойти, если кровь на анализ был сделан неправильно, с нарушением правил, или транспортировался ненадлежащим образом например, попал в лабораторию больше, чем через два часа после забора.
«Вероятность обнаружить вирус снижается». Когда нужно сдавать ПЦР-тест
Метод ПЦР позволяет идентифицировать в биологическом материале искомый участок генетического материала и обнаружить единичные молекулы ДНК микроорганизмов, не выявляемые другими методами. Расшифровка результатов ПЦР требует учета данных прочих исследований, хотя формально находки, полученные в процессе полимеразной цепной реакции исчерпывающе и однозначно описаны в бланке исследования, клиническом заключении лаборантов. Положительный результат ПЦР теста означает, что пациент в настоящее время инфицирован определенным патогеном. Виды теста методом полимеразной цепной реакции: качественная, количественная и генотипирование. Как правильно сдавать анализ и расшифровка отрицательного результата ПЦР при положительных показателях ИФА. ПЦР или полимеразная цепная реакция является золотым стандартом в диагностике многих инфекций.
«Вероятность обнаружить вирус снижается». Когда нужно сдавать ПЦР-тест
Петрова вы занимаетесь синтезом праймеров для ПЦР-тестов. Что такое праймеры и зачем они нужны в молекулярно-генетических исследованиях? В эпоху ковида этот термин — ПЦР — узнали все. Это распространенный, широко используемый метод, который мы используем для того, чтобы из всей огромной последовательности ДНК человека, у которого есть наследственные или соматические мутации в связи с онкологией, выделить определенный интересующий нас участок. Это можно выполнить при помощи химической реакции.
Скажем, из трех миллиардов букв ДНК выделяем только триста, и уже с ними работаем. В пробирке мы можем создать такую функцию, которую можно сравнить с поиском текста в компьютере. Сначала с помощью компьютера в базе данных генома человека мы подбираем две маленькие строчки, между которыми должен располагаться искомый текст. С помощью специального аппарата мы выращиваем нужные цепочки ДНК из последовательности букв нуклеотидов , получаем эти маленькие строчки в виде химического вещества в пробирке, добавляем в неё необходимые реактивы, меняем температуру, и в итоге получаем нужный нам участок генома.
Дальше его можно анализировать с помощью разных способов. Как анализ конкретных участков ДНК помогает в лечении онкозаболеваний? Мы постоянно ищем такие участки. Отбираем группу пациентов с похожими заболеваниями, достаточно дорогостоящими методами анализируем всю кодирующую последовательность их геномов и смотрим какие-то закономерности, к примеру, что у этой группы встречается с большей вероятностью какой-то генетический вариант.
Дальше мы этот вариант будем проверять на расширенной группе больных и здоровых людей. Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет. Если это наследственные раковые синдромы, которые мы ищем, то выделяем ДНК из крови. Также есть тесты на соматические мутации, но здесь уже используется биопсийный материал опухоли, в основном речь идет о выборе терапии, например, таргетных препаратов.
Процесс синтеза антител зависит от функционирования и выработки иммунокомпетентных клеток. Индивидуальные особенности организма могут стать причиной как ложноотрицательного, так и ложноположительного ответа. Перед назначением теста ИФА врач рассказывает пациенту о возможной ошибке, что вызывает ответный вопрос: «Какой анализ крови показывает гепатит С с минимальным риском получения неверных результатов? Дальнейшая тактика действий зависит от того, что покажет исследование.
В случае подтверждения диагноза, пациенту сразу же назначают гепатопротекторы, предупреждают о важности правильного питания и здорового образа жизни. Но таргетная терапия невозможна без определения уровня вирусной нагрузки и генотипа гепатита С. Некоторые лекарственные препараты могут спровоцировать обострение гепатита В. Поэтому для исключения осложнений, дополнительно назначают анализы на HBsAg.
HCV лечат только после получения отрицательного результата исследования. Виды: качественный, количественный и генотипирование При первичной диагностике гепатита С серологическим методом определяется титр вырабатываемых антител. Такой результат приблизительно показывает активность патологического процесса. Но максимально точную информацию доктор может получить только после изучения данных ПЦР.
В настоящее время практически во всех лабораториях анализ выполняют ультрачувствительным методом. Таким образом диагностика HCV возможно уже через 10—14 дней после заражения, реже — спустя 2,5—3 недели. В зависимости от целей, преследуемых в ходе исследования, доктор назначает конкретный тип теста. Существуют следующие разновидности ПЦР: Качественный.
При назначении диагностических тестов, у пациентов возникает вопрос, что показывает подобный метод исследования. Качественный анализ способом ПЦР — высокочувствительный тест, определяющий наличие РНК вируса в крови в минимальной концентрации. Обычно подобная разновидность полимеразной цепной реакции ставится по технологии обратной транскрипции. Проведение исследования возможно только одним способом — методом real-time.
В ходе подготовки материала к постановке ПЦР в образец добавляют краситель. После каждого цикла амплификации проводится автоматизированное количественное исследование в режиме реального времени. Нередко методику проводят в сочетании с обратной транскрипцией. Таким образом возможно качественное определение малого количества копий РНК вируса.
Анализ сдается проводится на конечной стадии диагностического процесса. Принцип исследования построен на разнице в последовательности нуклеотидов, что отличает один генотип вируса гепатита С от другого. Обычно анализ делают методом мультипраймерной мультиплексной ПЦР. При подозрении на носительство вируса, необходимо выполнить качественную ПЦР.
Если результат отрицательный, человек скорее всего здоров. Но для полного исключения заражения рекомендуют повторить исследование через 7—10 дней. Если же РНК вируса обнаружена, проводят дальнейшие тесты количественный и генотипирование. Показания к проведению лабораторного теста Основным показанием к сдаче крови на гепатит С методом полимеразной цепной реакции является положительный результат иммуноферментного анализа вне зависимости от разновидности: Total, дифференцированный тест на IgG и IgM.
Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1—1,5 мл в стерильные пробирки. Биоптаты, то есть материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2—3 мм3.
Хранение и транспортировка биоматериала. Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
Выделение ДНК из образца. Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором. Проведение ПЦР.
Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2—3 часа.
Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные, включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные, не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе. Регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия.
Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35—40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате. Интерпретация результатов исследования.
Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций.
Подготовка к анализу зависит от того, какой биологический материал вы сдаете.
Если кровь, то особо готовиться не надо. Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории если обследование положено по ОМС , или в частной, где окажутся подходящие цены. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ.
Результаты ПЦР
ПЦР-анализ, в отличие от теста на выявление антител, должен определить, присутствует ли вирус в организме прямо сейчас, или пациент перенес инфекцию в прошлом. ПЦР-тест даст более точный результат, если врач возьмет у пациента мазок с первого по пятый день заболевания. ПЦР или полимеразная цепная реакция является золотым стандартом в диагностике многих инфекций. Если вируса нет, а в ПАП-тесте указано «NILM», тестирования раз в 3 года будет совершенно достаточно. Чаще всего ПЦР-тест показывает ложноположительный результат из-за наличия в носу или ротоглотке фрагментов уже погибшего вируса, рассказал в интервью Лайфу доктор медицинских наук, практикующий врач, профессор Антон Ершов. Полимеразная цепная реакция почти для каждого из нас стала обыденностью, даже если этот каждый никогда и слов таких не слышал.
Маркеры гепатита С и расшифровка результатов количественного анализа HCV RNA
Вероятность ошибочного результата Получение ошибочного результата возможно. Это может быть объяснено несколькими причинами. Ошибка работы диагностического центра — лаборатории. Иногда нарушаются правила проведения исследования, неверно подготавливаются образцы.
Исследуемый образец загрязнен. Определение в крови гепарина — вещества, которое препятствует свертыванию крови. Определение в крови ингибиторов — веществ, задерживающих физико-химические процессы.
Применение различных способов и реактивов в разных лабораториях. Лучше проводить исследование в современной, хорошо себя зарекомендовавшей лаборатории. Для получения правильного результата важна чувствительность системы диагностики.
Первой строчкой анализа оценивается контроль взятия мазка КВМ у женщин, важно, чтобы он не был ниже установленной нормы. Если КВМ менее 4, то есть вероятность ошибки при исследовании. Что такое в анализе контроль взятия мазка КВМ? Это объем исследуемого материала, не позволяющий пропустить во время проведения реакции вирусные частицы. В норме по анализам у женщин вирус папилломы человека ВПЧ не обнаружен. Такая запись должна быть во всех строчках, в которых перечислены генотипы вирусов. При положительной реакции ПЦР на определенные генотипы напротив соответствующего вируса указано «обнаружен». Расшифровка количественного анализа на вирус папилломы человека ВПЧ показывает не только факт присутствия патогена, но и его концентрацию.
Чем это число больше, тем вероятность появления симптомов болезни, свойственной именно для этого генотипа, выше. Интерпретация результатов Анализ отрицательный, если при КВМ более 4 против каждого генотипа стоит ответ «не обнаружено». Это значит, что вируса нет? Это значит, что его нет в клинически значимом количестве, когда он способен вызывать патологический процесс. Результат положительный, когда при расшифровке анализа гинекологического мазка на вирус папилломы человека ВПЧ выявлена ДНК одного или нескольких типов вируса. Вирусная нагрузка, то есть количество вирусов, позволяет спрогнозировать возможность появления заболевания. Если в процессе лечения количество вируса уменьшается, то терапия эффективна.
Отжиг[ править править код ] Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей.
Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей при завышенной температуре , либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов при заниженной температуре. Время стадии отжига — 30 секунд [ источник не указан 803 дня ], одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Элонгация[ править править код ] ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента.
Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 минут. Количество специфического продукта реакции ограниченного праймерами теоретически возрастает пропорционально 2n — 2n, где n — число циклов реакции [15].
В основе анализа на ПЦР лежит создание большего числа копий генетического материала ДНК или РНК с помощью этих самых праймеров и специальных ферментов посредством серии циклов нагрева и охлаждения. Полученные амплифицированные сегменты далее методом гель-электрофореза или с помощью другой технологии сравниваются с другими нуклеотидными сегментами из известного источника например, патогенного микроорганизма для определения их идентичности.
Это один из основных методов обнаружения бактерий или вирусов на молекулярном уровне, с более высокой степенью точности, чем микроскопические или бактериологические исследования, и значительно более быстрый, чем метод культивирования. Это также единственный способ определить наличие генетических вариаций, указывающих на предрасположенность к онкологическим и другим заболеваниям. Чувствительность диагностических инструментов для выявления мутаций онкогенов и генов подавления опухоли была улучшена по крайней мере в десять тысяч раз благодаря ПЦР, что позволяет раньше диагностировать, например, такие виды рака, как лейкемия. Метод ПЦР также позволил разработать индивидуальную терапию для больных раком. Кроме того, ПЦР может использоваться для типирования тканей, которое имеет жизненно важное значение для имплантации органов. Образцы берут либо с помощью амниоцентеза либо с помощью биопсии ворсин хориона.
В отличие от многих других тестов, ПЦР тест способен обнаружить признаки заболевания на самых ранних стадиях инфицирования, так как для выделения искомого ДНК или РНК достаточно минимального количества генетического материала патогена в образце биоматериала. Другие виды исследования могут оказаться ложноотрицательными из-за того, что в образце недостаточно много вирусов или бактерий или организм не успел выработать достаточное количество антител. ПЦР-анализ проводится на образце одного из следующих видов биоматериала: кровь, слюна, слизь, ткань, гной, мокрота, моча. Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
Такая возможность существует при ПЦР-тесте, когда биоматериал получают с помощью соскоба эпителиальных клеток из ротоглотки. Что такое ПЦР, как работает метод ПЦР в диагностике, преимущества методики, показания, подготовка к проведению ПЦР-анализа, как проводится ПЦР-анализ, что показывают результата теста. ПЦР анализ на инфекции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии. Для диагностики папилломавирусной инфекции необходимо сдать анализ на ДНК папилломавируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или гибридизации.
Количественная ПЦР: суть анализа и расшифровка результатов
- Статьи по теме
- Результаты ПЦР диагностики - интерпретация.
- Преимущества ПЦР
- ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
- Азбука жизни. Зачем в онкологии нужны ПЦР-тесты и какую информацию о болезни хранит в себе ДНК
Статьи по теме
- Лабораторная диагностика коронавирусной инфекции
- Тест на Антитела к COVID-19
- ПЦР анализ 12: что это такое? Подготовка и сдача анализа, расшифровка результатов
- «Вероятность обнаружить вирус снижается». Когда нужно сдавать ПЦР-тест
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. Вторая полимераза необходима для коррекции ошибок, внесённых первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК, если был добавлен некомплементарный нуклеотид. Этот некомплементарный нуклеотид удаляет Pfu-полимераза. Смесь полимераз берётся в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше, чем Pfu-полимеразы. RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA [en] , ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера около 10 п. Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия длину праймера, его состав, температуру и пр. Групп-специфическая ПЦР group-specific PCR — ПЦР для родственных последовательностей внутри одного или между разными видами с использованием консервативных праймеров к этим последовательностям.
Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным генам 18S и 26S для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположностью этому методу является уникальная ПЦР unique PCR , где задача состоит в подборе праймеров для амплификации только одной последовательности изо всех родственных. ПЦР с использованием горячего старта [en] hot start PCR — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody [en] , то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР.
Анализ проверен временем, тщательно апробирован клинически, поэтому его часто назначают в качестве дополнительного обследования, чтобы выявить определенный тип вируса или микроба. Кроме медицины метод нашел применение в генетике, криминалистике, археологии.
ПЦР-диагностика играет ведущую роль в выявлении неврологических и урологических заболеваний. Использование передовых технологий позволяет: определить причины острых уретритов — берут соскоб клеток из мочеиспускательного каналы у мужчины или женщины, влагалища, цервикального канала; диагностировать циститы, особенно хронические — через мочу или соскоб из шейки мочевого пузыря; тщательно обследовать простатит — берется секрет простаты; определить воспалительные заболевания головки полового члена и крайней плоти — соскоб клеток высыпаний; диагностировать ряд кожных патологий. В гинекологии ПЦР-анализы — обязательная диагностическая процедура, входящая в профиль обследований различных женских патологий. В первую очередь это диагностика широкого спектра заболеваний, передающихся половым путем. Врач может назначить анализ при подозрении на хламидиоз, гонорею, герпес, вирусы папилломы человека.
В качестве биоматериала обычно выступают кровь, моча или вагинальный соскоб. Метод ПЦР — наиболее точный способ выявления Covid-19. Его преимущество в том, что он обнаруживает сам вирус. Подтвердить патогенного агента удастся даже при бессимптомном течении заболевания. И, наоборот, диагностика не даст положительного результата, если много антител, а самого вируса уже нет.
Однако если у беременной женщины высокий уровень вирусной нагрузки, то велика вероятность передать заболевание своему ребёнку. Считается, что нижняя норма концентрации РНК-вируса — до 600. Генотипирование Из-за того, что этот вирус подвержен высокой мутации, в ходе исследования очень важно определить, какой конкретно генотип находится в крови человека.
Всего существуют 11 генотипов гепатита С и множество их подвидов. Но на территории России распространены всего три: 1, 2 и 3. Генотипирование даёт возможность определить, насколько устойчивым оказался вирус.
От этого зависит метод лечения. Все генотипы гепатита С по-разному реагируют на лечение. Кроме того, генотипирование даёт возможность посмотреть, в каком состоянии находится печень больного.
Например, накапливание в печени жира указывает на то, что пациент страдает от 3 генотипа вируса. Анализ крови на данной стадии показывает цифру, которая характеризует генотип. Изредка случается, что определить генотип не получается, и в ответах из лаборатории указано «не типируется».
Это означает, что человек страдает от генотипа, нераспространенного в этой географической зоне. Чтобы обнаружить его, придётся сдать анализ еще раз, но с той системой диагностики, которая сможет его распознать. Считается, что наибольшее внимание следует уделить второму пункту, так как исходя из этих показателей, можно сделать прогноз, определить продолжительность лечения и его тип.
Отсутствие снижения виремии через 12 недель с начала лечения указывает на его неэффективность. Рекомендовано проводить анализ до начала терапии, на 4-й, 12-й и 24-й неделях лечения и через 24 недели после окончания курса. Длительность терапии и периодичность количественного определения РНК вируса гепатита С зависит от генотипа вируса и степени повреждения печени. Для чего используется исследование? Для подтверждения диагноза «вирусный гепатит С». Для прогнозирования течения вирусного гепатита С. Для мониторинга противовирусной терапии и решения вопроса о дальнейшей тактике лечения. При качественном обнаружении РНК вируса гепатита С.
При остром и хроническом вирусном гепатите С. При микст-гепатитах. При планировании, во время и после окончания противовирусной терапии. Низкая виремия наиболее благоприятный прогноз течения заболевания и эффективности терапии.